WWW.KNIGA.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Онлайн материалы
 

«УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра здравоохранения – Главный государственный санитарный врач Республики Беларусь _И.В. Гаевский 23.12.2013 Регистрационный № 007-1013 МЕТОД ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ ...»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Министра здравоохранения –

Главный государственный санитарный врач

Республики Беларусь

_________________________И.В. Гаевский

23.12.2013

Регистрационный № 007-1013

МЕТОД ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В

РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И

ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЛЮША

(BORDETELLA PERTUSSIS), ПАРАКОКЛЮША (BORDETELLA PARAPERTUSSIS) В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

инструкция по применению

УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК:

Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии»

АВТОРЫ:

к.м.н. Колодкина В.Л., Мартынов В.С.

Минск 2013 В настоящей инструкции по применению (далее – инструкция) изложен метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, использование которого повысит эффективность лабораторной диагностики коклюшной и паракоклюшной инфекций в Республике Беларусь.

Инструкция предназначена для врачей-бактериологов, врачейэпидемиологов, врачей-лаборантов, врачей-лабораторной диагностики, врачейинфекционистов, иных врачей – специалистов организаций здравоохранения, оказывающих медицинскую помощь.



1 Показания Необходимость выявления и дифференциации возбудителей коклюша и паракоклюша у кашляющих пациентов.

2 Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов, изделий медицинской техники

- Автоматические дозаторы переменного объема (от 0,1 до 10 мкл, от 20 до 200 мкл, от 100 до1000 мкл);

- Вортекс;

- Компьютер с программным обеспечением для управления прибором ПЦР в режиме реального времени, хранения данных и анализа;

- Ламинарный бокс с бактерицидной лампой;

- Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 13 тыс. об/мин;

- Морозильник;

- Набор реагентов для выделения ДНК из клинических образцов;

- Набор олигонуклеотидов (праймеров и проб);

- Одноразовые наконечники с фильтром до 10, 100, 200, 1000 мкл;

- Одноразовые пластиковые микропробирки на 0,2, 0,5, 1,5 мл;

- Одноразовая пластиковая посуда для постановки ПЦР в режиме реального времени – микропробирки, стрипы, 96-луночные плашки (посуда должна подходить к прибору, на котором ставится РТ-ПЦР);

- Реактивы для проведения ПЦР – фермент Таq ДНК-полимераза (5 ед/мкл);

10буфер для Taq полимеразы без MgCl2; 10 мМ смесь дНТФ; 25 мМ раствор МgCl2; ДМСО 25%;

- Твердотельный термостат для микропробирок на 1,5 мл и 0,5 мл;

- Термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени;

- Холодильник;

- Штативы для микропробирок, автоматических пипеток и наконечников к автоматическим пипеткам.

3 Подготовка клинических образцов для исследования

3.1 Клинический материал

- мазки со слизистой задней стенки ротоглотки,

- секционный материал (трахеи и легких),

- культуры микроорганизмов.

К мазку, взятому сухим ватным тампоном и помещенному в стерильную пластиковую пробирку (1,5-2 мл), добавляют 300 мкл стерильной бидистиллированной воды и тщательно перемешивают на вортексе. Тампон аккуратно удаляют из пробирки стерильным пинцетом, отжав его о стенки пробирки. Полученный смыв с тампона используют для выделения ДНК.





Хранение мазков: мазки анализируются немедленно после поступления, или приготовленный смыв с тампона хранится при -20°C.

Секционный материал гомогенизируют в лизирующем буфере, прилагаемом к набору для выделения ДНК, и полученную суспензию используют для выделения ДНК.

Культуры микроорганизмов: колонию микроорганизмов ресуспендируют в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида или 0,01 М калий-фосфатном буфере, pH 7,0. Полученную суспензию используют для выделения ДНК.

3.2 Выделение ДНК Экстракцию ДНК возбудителей коклюша, паракоклюша из образцов клинического материала осуществляют стандартным методом с использованием коммерческого набора для выделения ДНК в соответствии с прилагаемой инструкцией. Выделенные образцы ДНК хранят при -20°С.

–  –  –

Общий пул приготовленной 25 кратной смеси праймеров и проб разливают в пробирки по 20 или 50 мкл и хранят при -20С, избегая многократного размораживания и замораживания растворов. Смесь размораживается непосредственно перед постановкой ПЦР. Для постановки РТ-ПЦР готовят параллельно две реакционные смеси, которые отличаются только смесью праймеров и проб.

В первую смесь добавляют 25х смесь праймеров и проб № 1, во вторую – 25х смесь праймеров и проб № 2.

Таблица 4 – Реакционная смесь для ПЦР №1 и №2

–  –  –

Приготовленные реакционные смеси разливают в лунки планшета или пробирки для РТ-ПЦР по 20 мкл так, что бы на каждый образец и контроли приходилось по две лунки со смесью №1 и по две лунки со смесью №2. По 5 мкл ДНК-образца добавляют в соответствующие лунки со смесью №1 и параллельно в лунки со смесью №2. Положительный контроль в объеме 5 мкл добавляют в лунки в последнюю очередь. В качестве положительного контроля используют смесь ДНК B. pertussis, B. parapertussis (по 100 копий геномной ДНК на реакцию) и ДНК человека (50 пг на реакцию). В качестве отрицательного контроля используют 5 мкл Н2О.

Приготовление реакционных смесей, раскапывание их в лунки планшета или пробирки и добавление ДНК-образцов проводится на льду. Перед постановкой в амплификатор следует осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на центрифуге/вортексе (1-3 с) или встряхиванием планшета.

4.1 Проведение амплификации с детекцией в режиме реального времени Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме реального времени) для выполнения соответствующей прграммы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала (таблица 5).

Таблица 5 – Программа амплификации ДНК Температура,°С Время Кол-во циклов 5 мин 10 с 1 мин детекция флуоресцентного сигнала Детекция флуоресцентного сигнала проводится по каналам для флуорофоров FAM/Green и Cy5/Red для проб с реакционной смесью №1 и для флуорофоров FAM/Green и TAMRA/Orange для проб с реакционной смесью №2.

Установить планшет или пробирки в ячейки реакционного модуля прибора.

Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала.

По окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов.

5 Результаты

5.1 Определение CT – значение: номер цикла в котором сигнал флюоресценции пересекает пороговую линию (threshold).

Threshold – пороговый уровень флюоресценции.

Примечание – величина Threshold устанавливается вручную на уровне 10 % (FAM, TAMRA, Cy5), от максимального уровня флуоресценции положительного контрольного образца (ПКО) в последнем цикле амплификации. При этом кривая флуоресценции ПКО должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, переходящего в линейный подъем.

5.2 Анализ и интерпретация результатов Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР c детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции на каждом из используемых каналов с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла CT.

Таблица 6 – Гены-мишени и их каналы детекции

–  –  –

Принцип анализа результатов амплификации следующий:

анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам.

Результат амплификации по каналу считается положительным если кривая флуоресценции имеет типичный для ПЦР в режиме реального времени Sобразную форму, однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, и значение порогового цикла CT для данного канала менее граничного значения, отрицательным – в случае отсутствия кривой типичной формы, не пересекающейся с пороговой линией (нет значения CT) или если определено значение порогового цикла CT, превышающее указанное граничное значение.

Образец считается положительным на ДНК B. pertussis, если сигнал продуцируется в двух каналах: FAM/Green на IS481 и FAM/Green на ген тиолазы и значение CT ниже 40 для обеих мишеней, или сигнал продуцируется дважды только в канале FAM/Green на IS481 при повторном исследовании новой аликвоты.

Образец считается положительным на ДНК B. parapertussis если сигнал продуцируется в канале Cy5/Red на IS1001 и значение CT ниже 40.

Образец считается отрицательным, если сигнал флюоресценции отсутствует в каналах FAM/Green на мишень IS481, FAM/Green на тиолазный ген и Cy5/Red на IS1001 или значение CT сигнала флюоресценции равно или выше 40, но при этом сигнал присутствует в канале TAMRA/Orange на ген GAPDH человека и значение CT ниже 40.

–  –  –



Похожие работы:

«1 Цели освоения дисциплины Основной целью изучения дисциплины "Перспективные направления создания сортов" является формирование способностей применения основных лабораторных и полевых методов анализа в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений. В процессе изучения дисциплины "Перспекти...»

«Руководство пользователя m2 AAD 03.13.02 RU содеРЖаНИе Предупреждение 1. Введение 2. Конструкция 2.1 Отдельные части прибора 2.2.1 Контрольный блок 2.2.2 Блок управления 2.2.3 Пиропатрон 3. Функция 3.1 Принцип действия 3.2 Функциональные...»

«Пояснительная записка Процесс возрождения национального самосознания, получивший развитие в последние годы, обусловил проявление интереса к истории родного края, своего народа. Байкальский регион в своем географическом положении называют воротами в Азию, где переплетаются духовные культуры Востока и З...»

«Муниципальное общеобразовательное учреждение "Средняя общеобразовательная школа №14" г. Воркуты РАССМОТРЕНА УТВЕРЖДЕНА школьным методическим приказом директора объединением от 30.08.2013 № 410 учителей гуманитарного цикла Протокол № 1 от 30.08.2013 Рабочая программа учебного предмета "Биология" среднего о...»

«1 Пояснительная записка Рабочая программа составлена с учетом Федерального Государственного стандарта, программы по биологии авторов И.Н. Пономарева, Н.М. Чернова ( Природоведение. Биология. Экология : 5 – 11 кл.: программы. М.: ВентанаГраф, 2010. – 176 с. ). Рабочая программа ориентирована на использование учебника: Пономарева И.Н. Биолог...»

«"Рассмотрено" "Согласовано" "Утверждено" Руководитель МО Заместитель директора по УВР Директор МБОУ "СОШ №21" _/ _/ /_ Протокол № от ""_2016 г. "_"_2016 г. Приказ № от ""_2016 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА Литвиновой Анны Римовны учителя биологииI кат...»

«Аннотация к программе по биологии для 11 класса (профильный уровень) Рабочая программа разработана на основании следующих документов: Федерального компонента ГОС среднего (полного) общего образования по биологии (2004 г.), Федерального базисного учебного плана (2004 г.), Примерной программы среднег...»

«Рабочая программа по биологии 10 класс Рабочая программа по биологии составлена на основе Федерального компонента государственного стандарта среднего (полного) общего образования на базовом уровне и программы для общеобразовательных уч...»








 
2017 www.kniga.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.